2023年1月，我校兽医学院黄耀伟教授课题组以华南农业大学兽医学院/岭南现代农业广东省实验室为第一单位，在国际病毒学权威杂志Journal of Virology在线发表题为“Chicken or porcine aminopeptidase N mediates cellular entry of pseudoviruses carrying spike glycoprotein from the avian deltacoronaviruses HKU11, HKU13, and HKU17”的文章（链接：https://journals.asm.org/doi/10.1128/jvi.01947-22），首次报道表达三种代表性野禽丁型冠状病毒（Deltacoronavirus, DCoV）——HKU11, HKU13或HKU17 的刺突蛋白（Spike）的假病毒可分别通过鸡或猪氨基肽酶N(APN)介导入侵相应种属的细胞，揭示自然界种类繁多的野禽DCoVs具备潜在的野禽到家禽、以及鸟类到哺乳类的跨物种传播能力。
依据国际病毒分类委员会（ICTV）的分类，目前冠状病毒科成员分为Alphacoronavirus, Betacoronavirus, Gammacoronavirus, Deltacoronavirus四个属，其中DCoV又分为Andecovirus, Buldecovirus, Herdecovirus三个亚属并包含七个种。DCoV主要感染约30个科，108个属的不同种类野禽，具有广泛的演化多样性和复杂的宿主生态学特征，但极少受到研究人员关注。鉴定宿主受体是研究冠状病毒入侵细胞与跨种传播机制的关键。目前没有一种野禽DCoV被分离培养出来，对其入侵细胞受体也不清楚。
在DCoV的Buldecovirus亚属中，猪丁型冠状病毒（porcine deltacoronavirus，PDCoV，或称HKU15）是唯一一种感染哺乳类的成员，属于新发猪肠道冠状病毒的一种，近年来已在中国、东南亚、北美洲等区域引发猪场新生仔猪腹泻疫情，造成养猪业经济损失。新冠肺炎疫情暴发以来，在海地的三名发热儿童中检测到PDCoV核酸，其序列分别属于北美谱系与中国谱系，表明PDCoV可能已经从动物外溢至人类。
自2013年起，黄耀伟课题组一直致力于几种新发与再现猪肠道冠状病毒，包括PDCoV的基础研究。在2018年率先报道猪APN为PDCoV的主要入侵细胞受体（Journal of Virology, 2018, 92:e00318-18）；进一步鉴定出其它四个不同种属（人、小鼠、猫、鸡）APN也可以介导PDCoV进入细胞，并且另一种宿主因子唾液酸参与PDCoV刺突蛋白S1亚基的受体结合与病毒中和作用（Journal of Virology, 2021, 95:e01118-21）。受以上结果启发，课题组进一步猜想可能会有特定种类的野禽DCoVs（如Buldecovirus亚属成员）也利用APN入侵细胞。
本研究首先分析了DCoV Andecovirus, Buldecovirus, Herdecovirus三个亚属成员的S和S1 氨基酸序列，系统演化构建结果显示Buldecovirus亚属分为迥异的两组（G1及G2），其中夜莺DCoV HKU11、文鸟DCoV HKU13、美国麻雀DCoV ISU42824与PDCoV同属于G1；而G2包括中国麻雀DCoV HKU17、中东的猎鹰DCoV HKU27、鸨DCoV HKU28与鸽子DCoV HKU29。G1组的分型与基于复制酶RdRp的Buldecovirus分型一致，但G2组则更接近Herdecovirus亚属（图A和图B）。因此，Buldecovirus G2组成员很可能是在病毒演化过程中来自于G1组（提供全长基因组骨架）与Herdecovirus亚属（提供并取代了G1的S基因）的重组产物，从而两种在中国香港和美国分别鉴定的麻雀DCoV有不同的进化路径。与之相应，同源建模分析HKU11和HKU13的RBM结构更接近已知的PDCoV，而HKU17的RBM则与PDCoV有较大区别。
进一步的免疫共沉淀实验显示，HKU11、HKU13、HKU17的S1与鸡APN(chAPN)或猪pAPN(pAPN)可以相互作用；流式细胞分析显示，以上的S1纯化蛋白可以在细胞表面结合稳定表达chAPN 或pAPN的PDCoV非易感细胞，以及结合内源表达chAPN 或pAPN的鸡细胞或猪细胞。制备携带这些DCoV S蛋白（包括来自ISU42824的S）的假型慢病毒可以分别感染稳定表达chAPN 或pAPN的非易感细胞与内源表达chAPN 或pAPN的鸡细胞或猪细胞。而敲除chAPN 或pAPN后，这些假病毒对相应的敲除鸡细胞系或猪细胞系的入侵水平显著下降或几乎消失（图C,和图D）。最后，与此前报道的PDCoV感染细胞结果类似（Emerging Microbes & Infections, 2020, 9:457-468），加入胰酶可以显著促进这些假病毒入侵猪肠道上皮细胞（图E）。以上结果表明，夜莺 HKU11、文鸟HKU13、以及两种麻雀DCoV（来自美国的ISU42824与来自中国香港的HKU17），均有可能利用chAPN 或pAPN作为受体入侵细胞，尽管HKU17的S蛋白在进化上与PDCoV及ISU42824有较大差异。
本研究对此前极少关注的野禽丁型冠状病毒病原生态学及跨种传播潜力进行了分析，首次揭示了不同DCoVs在其野禽宿主之间交叉传播的共同分子基础。同时，这也是课题组过去几年持续对PDCoV入侵细胞和跨种传播分子机制进行原创研究的延续。鉴于野禽DCoVs的多样性（可能不亚于蝙蝠类CoVs），以及已有PDCoV跨种传播的先例（据分子钟分析推测，PDCoV与麻雀DCoV ISU42824成员同源，大约在上世纪九十年代初从麻雀跳跃到猪，并最后外溢至人类），这一大类冠状病毒将来是否从各自的野禽宿主，继续外溢至家禽和哺乳类，值得关注和进一步监测。
黄耀伟教授为论文通讯作者。本研究受广东省岭南实验室科研项目(NG2022001)、国家自然科学基金-广东省区域创新联合基金重点项目(U22A20521) 及浙江省自然科学基金重点项目(LZ22C180002)资助。研究工作得到了兽医学院冯耀宇教授、哈尔滨兽医研究所汤艳东研究员的大力支持和协助。
文图/兽医学院 刘毅新
